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ibidiµ-Slide2Well共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案|共培養(yǎng)延時顯微觀察斑馬魚幼蟲

更新時間:2023-06-14   更新時間:2023-06-14   點(diǎn)擊次數(shù):1068次

  ibidiµ-Slide2Well共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案,實(shí)驗(yàn)描述了將斑馬魚幼蟲嵌入低百分比低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行延時顯微鏡觀察的過程。


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  2.共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備  

  

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  (ibidi, 81806)

  

  • 熱混合器 (例如,Eppendorf,ThermoMixer C)

  

  • µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片,ibiTreat底部處理 (ibidi, 81806)

  

  • 塑料移液管

  

  • 可選: 小刷子

  

  • 顯微鏡

  

  3.實(shí)驗(yàn)步驟

  

  實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作:

  

  在開始實(shí)驗(yàn)之前,按照“緩沖液和溶液"部分的描述準(zhǔn)備LMPA。保持在35°C,直到需要使用。如果瓊脂已經(jīng)提前準(zhǔn)備好,可以在熱混合器中重新加熱 (~80°C),然后讓瓊脂冷卻 (~35°C)。

  

  裝載: 

 

  在我們小組的某些實(shí)驗(yàn)中,對斑馬魚脊髓進(jìn)行了機(jī)械性損傷。如果這樣做,建議請在裝載前讓幼魚恢復(fù)至少30分鐘。在脊髓橫切后,嵌入瓊脂的初始存活率為80%。這些幼魚在瓊脂中觀察48小時后也都存活了。未受傷的幼魚的初始存活率接近100%。

  

  1. 使用三氯-甲-烷使用溶液麻醉斑馬魚幼魚2分鐘。

  

  2. 使用塑料移液管在µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片的每個孔中放置一只幼魚,并使用一些多余的魚水。

  

  3. 對每只幼魚單獨(dú)執(zhí)行以下步驟(以避免變干):

  

  3.1. 使用塑料移液管除去所有魚水。

  

  3.2. 向小孔中加入50µl LMPA,以覆蓋幼魚。

  

  3.3. 使用刷子或小的移液管頭將幼魚定位到適當(dāng)?shù)奈恢茫▊?cè)面位置,盡可能水平和直立,具有統(tǒng)一的對準(zhǔn),即始終向左,卵黃在底部)。

  

  4. 讓LMPA凝膠固化(0.5%凝膠約需20-30分鐘)。

  

  5. 可選:用包含80mg / L三氯-甲-烷庫存溶液的1x魚水覆蓋固化的LMPA凝膠,以進(jìn)行連續(xù)成像的麻醉。

  

  6. 用自帶的蓋子蓋住µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片,以避免蒸發(fā)。

  

  7. 斑馬魚幼魚已經(jīng)上樣好準(zhǔn)備成像

  

  在48小時的成像期間,如果蓋子緊閉,則無需在瓊脂上方加入魚水,因?yàn)闃?biāo)本不會變干。這也使得可以進(jìn)行正置顯微鏡觀察,而不必?fù)?dān)心灑出來?! ?/span>

  

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圖1:斑馬魚幼蟲嵌入LMPA中的µ-Slide 2孔共培養(yǎng)器


  延時顯微鏡觀察:

  

  這種樣品制備方法被用于連續(xù)延時顯微鏡,以及使用德累斯頓技術(shù)大學(xué)CRTD的核心設(shè)施——光學(xué)顯微鏡設(shè)施的各種顯微鏡在不同時間點(diǎn)拍攝某些視場的快照。 這包括倒置和正置,廣角和共聚焦顯微鏡?! ?/span>

  

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圖2:A)斑馬魚幼蟲受精后72小時,埋入瓊脂3小時后的整個µ-Slide 2孔共培養(yǎng)器的亮場瓦片掃描,共有18條幼魚

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